Изучение влияния препаратов-стимуляторов на регенерацию кожи при термической травме

Цель исследования: оценка эффективности местного лечения ожогов на основе применения экспериментальных образцов препаратов — стимуляторов регенерации. В исследовании использовались беспородные белые крысы-самцы (18 голов), 3 группы были сформированы методом аналогов (№ 1 — контрольная, без лечения, и две опытные, группа № 2 получала препарат ПСР-1, группа № 3 — ПСР-2). После термической травмы проводились планиметрия и гистологические исследования в динамике. Количественные данные, полученные в эксперименте, обрабатывались с использованием методов вариационной статистики. Определялись средняя арифметическая, ошибка средней арифметической, уровень значимости (р<0,05) различий средних величин оценивался на основании t-критерия Стью-дента. Было выявлено, что после воздействия горячей пробирки на кожу примерно течение 30 секунд в месте контакта формировался участок сухого коагуляционного некроза со струпом белесоватого цвета — мягкой тонкой корочкой. Процессы регенерации у животных опытных групп были выражены уже к 10-му дню по сравнению с контрольной группой, а к 21-м суткам эпителий и дерма имели фактически нормальное строение у животных, получавших препараты ПСР-1 и ПСР-2.

Введение

Пирогенная ситуация, приводящая к термическим травмам, находится в зависимости от комплекса негативных факторов (алкоголизм, наркомания, криминализация общества, технические аварии и катастрофы). Ежегодно более 10 миллионов человек в мире получают ожоги такой степени тяжести, что требуется медицинская помощь, и нередко становятся причиной инвалидности [1]. Термическая травма (ТТ) может быть обусловлена воздействием бытовых, производственных и военных термических повреждающих факторов. Изучение эффективных способов терапии ТТ актуально в контексте необходимости снижения экономического бремени на нехирургическое и хирургическое лечение термической травмы и ее последствий, а также на непрямые экономические затраты на реабилитацию пациентов, перенесших термическую травму. В этой связи проблема восстановления кожного покрова при ожогах и поиск оптимальных терапевтических средств для лечения ТТ остаются крайне актуальными [1, 2]. Особое внимание в терапии ТТ привлекают биоактивные раневые покрытия, к которым относятся материалы на основе биологически активных полимеров природного происхождения, таких как гиалуроновая кислота, альгинаты и др. (Derma Col (DennaRite, США), Algicell (Derma Sciences, США), Algisite (Smith&Nephew, Великобритания), Cutimed alginate (BSN medical GmbH, Германия) и др.), которые могут модулировать клеточные сигналы, рост, дифференциацию клеток в области повреждения. Эти раневые покрытия используется при ожогах первой и второй степени, а также при других поражениях кожи, и крайне востребованы в настоящее время [1-3]. Таким образом, введение в раневые покрытия стимуляторов регенерации крайне актуально, в этой связи была предпринята попытка изучения регенеративного процесса при экспериментальном воспроизведении ТТ с использованием препаратов стимуляторов регенерации (ПСР): ПСР-1 — лиофилизированная бластема тритона с электромагнитной обработкой и ПСР-2 -препарат из фибробластов, обработанных аппаратом электро-, магнито- и светотерапии «ИМЕДИС-ЭКСПЕРТ», Регистрационное удостоверение № ФС 022а2005/2263-05 от 16 сентября 2005 г. и [3, 4].

Цель исследования: оценка эффективности местного лечения ожогов на основе применения экспериментальных образцов ПСР-1 и ПСР-2 в эксперименте.

Задачи исследования: изучить эффективность применения опытных образцов ПСР-1 и ПСР-2 в сравнении для лечения ожоговых ран у лабораторных животных при оценке общего состояния животных и планиметрического исследования и оценить эффективность регенераторного процесса при применении ПСР в эксперименте.

Материал и методы

Исследования проводили в соответствии с правилами качественной лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н), а также правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997 г.).

Экспериментальную часть проводили в медико-биологическом центре биомоделирования ФГБОУ ВО Кировского ЕМУ Минздрава России.

Исследование проводилось на 18 беспородных белых крысах-самцах массой от 280 до 320 грамм. Животные содержались в общепринятых условиях: температура воздуха +20-22 °С, влажность 55-60%. Содержание индивидуальное, подстил в виде древесных пеллет и стружки. Кормление экспериментальных животных производилось полнорационными гранулированными комбикормами, обеспечивался свободный доступ животных к воде. Моделирование эксперимента проводили на основании результатов научных работ, направленных на создание оптимальной методики воспроизведения ожога на лабораторных животных [5, 6].

В день, предшествующий моделированию патологии, удаляли шерсть с межлопаточной области крысы путем выстригания и выбривания безопасной бритвой. Для моделирования патологии животное вводили в наркоз (эфир). После введения животного в наркоз, моделировали термический ожог: пробирку заполняли горячей водой, помещали ее вертикально в кипящую воду на 2/3 высоты, прогревали в течение 1 минуты и затем приводили в плотный контакт с оголенным участком кожи животного, находящегося под действием наркоза, на 30 секунд. Полученная рана соответствовала II-III степени ожога. Затем экспериментальные животные были разделены на три группы равной численности: контрольную (воспроизводили термическую травму без лечения) и опытные (аналогичные контрольной, но с дополнительным введением препаратов ПСР-1 — 2-я группа и ПСР-2, соответственно 3-я группа. Животным контрольной и 2-й и 3-й групп наносили ТТ по разработанной ранее методике [5-7], включающей контактный термический ожог кожи спины (площадь до 10% поверхности тела). Лечение начинали сразу — на раневую поверхность животных

2-й и 3-й опытных групп наносились образцы мази. Продолжительность лечения животных составляла

21 сутки. Лечебные манипуляции заключались в ежедневном трехразовом нанесении мази на раневую поверхность лабораторным животным с ожогами и выпойкой соответствующих препаратов в количестве 1 мл на животное 1 раз в день.

Эффективность местного лечения ожоговых ран оценивали по методике Л.Н. Поповой [7]. При подсчете использовали формулу:

где п — количество полных ячеек размером 1×1 мм2; к — количество неполных ячеек размером 1×1 мм2; С — площадь одной ячейки размером 1×1 мм2.

На седьмые, десятые, четырнадцатые и двадцать первые сутки вновь измеряли раны. Изменение площади раны в ходе заживления считали с помощью формулы:

где So — площадь раневой поверхности при предшествующем измерении; St — площадь раневой поверхности через промежуток времени t.

Животных из эксперимента выводили методом ингаляции эфирных паров, были взяты фрагменты участка ТТ и здоровой ткани для приготовления гистологических препаратов. Парафиновые гистологические срезы проводили по общепринятым стандартным методикам. Использовали окраску гематоксилином и эозином. Фотографирование проводилось с применением системы Vision Bio (Epi 2014 г.). Полученные экспериментальные данные обработаны статистически. Определялись средняя арифметическая, ошибка средней арифметической, уровень значимости (р<0,05) различий средних величин оценивался на основании t-критерия Стьюдента.

Результаты исследований

Все экспериментальные животные моделирование патологического процесса перенесли хорошо и вернулись к привычной активности. Гибель животных до завершения эксперимента не наблюдали.

После моделирования ожоговой раны формировался некротический участок. Площадь смоделированной раны в среднем составила 395,18 ± 13,08 мм2. На четырнадцатые, двадцать первые сутки отбирали образцы кожи у животных всех групп. Проведенные планиметрические исследования показали, что у экспериментальных животных при применении терапии восстановительные процессы протекали намного быстрее, чем в контрольной группе. В первые сутки после ожога во всех группах ожоговая рана имела четкие границы с утолщением и уплотнением ожогового струпа. Цвет струпа в опытных группах буровато-коричневый, на ощупь плотный, при надавливании экссудата не отмечалось, в контрольной группе кожа в месте ожога красновато-бурого цвета, имеется отечность. На десятые сутки у всех животных 1-й опытной и у 25% 2-й группы наблюдается отхождение раневых струпов по краям ожоговой раны (рис. 1). При надавливании экссудат не выделяется.

Гистологические исследования на 10-е сутки после моделирования ожога во всех исследуемых препаратах выявляли истончение эпидермиса и выраженную зону некроза (гомогенный пласт), которая отграничивалась грануляционной тканью. Волосяные фолликулы разрушены, над ними имеются некротические массы. В строме наблюдается отек, с умеренной лейкоцитарной инфильтрацией, коллагеновые волокна утолщены. В гиподерме также отмечаются выраженная гиперемия, отек и диффузная воспалительная инфильтрация. У животных контрольной группы по сравнению с животными опытных групп инфильтрация более выражена, особенно на границе дна раны и струпа. Также отметили, что на 10-е сутки в группе № 2 несколько меньше выражен клеточный отек. Наблюдается локальное отделение струпа от поверхности раны.

К четырнадцатым суткам вид раны у экспериментальных животных значительно отличался от контрольных животных. Так в группе № 2 у всех животных раневой струп практически отошел. Раневой струп у животных группы № 3 по всему диаметру раны отошел, но держался на поверхности раны. У животных контрольной группы визуально рана мало изменилась по сравнению с 10 сутками (рис. 1.1а, рис. 1.2а, рис. 1.3а). К 21 суткам у животных опытной группы № 2 ожоговые раны почти зажили и имели небольшую площадь.

У животных 3-й группы также начинается отхождение раневой корки по краям, более интенсивное по сравнению с контрольной. Выделение экссудата в 1-й и в 3-й группах также не отмечено, однако имеются гиперемия и отек, которые отсутствуют в опытной группе, получавшей ПСР-1 (рис. 1.16, рис. 1.26, рис. 1.36). Таким образом, установлено, что к 21-му дню эксперимента наилучшим терапевтическим эффектом обладал ПСР-1, так как у 80% животных группы, получавшей ПСР-1, струпов не было, а оставшийся у 1 животного имел крайне незначительный размер (рис. 1.26). У животных 3-й группы, получавшей ПСР-2 частично держались струпы, однако у контрольной группы струпы держались плотнее, также в контрольной группе визуально площадь уменьшилась незначительно (рис. 1.36). Относительная убыль площади поверхности раны во всех группах после ТТ показана на рис. 3.

Рис. 2. Участок кожи ожоговой раны на 21-е сутки (1а, б-группа без лечения; 2 а, б-группа, получавшая ПСР-1; За, б-группа, получавшая ПСР-2). Окраска гематоксилин-эозин. Ув. х 40

На 21-е сутки при анализе гистологических препаратов отмечено, что в группе, не получавшей лечения, сосочки дермы значительно сглажены, в виде слегка волнистой линии, кровеносные сосуды дермы расширены. В дерме имеется небольшой отек стромы, на препаратах визуализируются тонкий слой эпителия вокруг волосяных фолликулов и незначительная инфильтрация (рис. 2.1а). На препаратах ТТ кожи в данной группе эпидермис тонкий с небольшим ороговением. В центре среза эпидермис отсутствует, однако в этом месте хорошо выражена грануляционная ткань, с диффузной макрофагальной инфильтрацией. Помимо того, что в дерме сглажен сосочковый слой, также коллагеновые волокна деформированы и утолщены со взаимопараллельным расположением, между волокнами имеются скопления фиброцитов и фибробластов, ядра которых окрашены достаточно интенсивно.

Эластические волокна практически не визуализируются (рис. 2.1а, рис. 2.16). В гистологических препаратах группы ТТ, получавшей ПСР-1, эпидермис кожи имеет большую толщину, чем во всех группах исследуемых препаратов. В подлежащей дерме имеется незначительный отек. На периферии препарата хорошо просматривается типичная диффе-ренцировка на зоны (эпидермис, дерма и гиподерма), что характерно для всех групп, получавших лечение. К 21-м суткам общая динамика регенерации была сходной, однако при детальном анализе гистологических препаратов у исследуемых групп животных отмечено, что в группе, не получавшей лечение, сосочки дермы более сглажены, а кровеносные сосуды дермы расширены, хотя и выявляется ее характераная структура. Волокна соединительной ткани — розового цвета (рис. 2.1а).

К 21-м суткам в 3-й группе животных, получавших препарат ПСР-2, исследуемый участок кожи имеет несколько истонченный эпидермис и слабое ороговение, также имеется небольшой клеточный отек в виде просветления перинуклеар-ных пространств (рис. 2.36). Сосочки дермы менее сглажены, чем у контрольной группы. У группы, получавшей ПСР-1, имеются умеренная базофилия кол-лагеновых волокон и незначительный отек стромы. В собственно коже коллагеновые волокна несколько утолщены, но меньше, чем в исследуемых препаратах ТТ 2-й группы. Особенно ярко визуализируется регенерация в области волосяных фолликулов, также их эпителий пролиферирует в большей степени, чем в группе, получавшей ПСР-2 (рис. 2).

Площадь регенерации поверхности раны,%
Рис. 3. Относительная убыль площади поверхности раны после ТТ, %

Обсуждение

Наиболее важным звеном в комплексе процессов регенерации эпидермиса при ТТ является утолщение эпидермального пласта за счет размножения стволовых клеток (СК). Известно, что в эпидермисе имеются два типа клеток, способных к митотическому делению и играющих важную роль в регенеративных процессах, это редко делящиеся региональные эпидермальные СК (самоподдерживающиеся, обладающие способностью к дифференцировке клетки базального слоя эпидермиса) и активно пролиферирующие транзиторные СК. Клетки первой группы лежат на базальной мембране, они тесно взаимодействуют с ней с помощью полудесмосом и ряда адгезивных молекул.

Клетки, образовавшиеся в результате деления этих клеток, формирующие шиповатый слой, также являются субпопуляцией клеток, способных к делению. Этот слой является переходным, то есть эти клетки эпидермиса переходят к терминальной дифференцировке. Митотическая активность базальных клеток во время ТТ зависит как от толщины эпителиального слоя, так и от силы повреждающего агента. Процесс регенерации контролируется гормонами и факторами роста, а также зависит от силы повреждающего агента и площади повреждения. В настоящее время активно ведется поиск маркеров регенерации, так как отсутствуют базовые критерии, что затрудняет процесс изучения механизма регенерации и активации эпидермальных стволовых клеток. Известно, что основными маркерами данного процесса являются трансформирующий фактор роста — бета-рецептор типа II и молекула адгезии нервных клеток, которые позволяют проводить точный анализ анатомических регенерирующих отделов волосяных фолликулов [8-10].

Так как СК эпидермиса имеют более простую структуру и меньше органелл, чем основная масса клеток этого слоя, для них характерны очень высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение и меньшее количество органелл, эти морфологические особенности и лежат в основе идентификации. Однако только морфологические методики не позволяют надежно идентифицировать СК [11-14]. К тому же среди СК волосяного фолликула имеются 2 популяции клеток. Первая из них располагается в дермальном сосочке в самой нижней части волосяного фолликула. Вторая популяция находится в бугорке самого фолликула, располагаясь ближе к его верхней части, и находится перед устьем сальной железы.

Размножение и дальнейшая дифференцировка этих клеток дают начало различным типам клеток волосяного фолликула и сальных и потовых желез. При изучении гистологических препаратов обнаружили, что в месте повреждения кожи при ТТ на фоне применения ПСР-1 и ПСР-2 регенерация идет как за счет СК базального слоя, так и за счет СК сосочка волоса и СК волосяного фолликула (рис. 2.2, 2.3), полученные данные вполне согласуются с результатами ряда отечественных и зарубежных исследователей [11, 12]. До сих пор регенераторная активность клеток волосяного фолликула изучена недостаточно.

Исследователи University of Pennsylvania обнаружили специфическую особенность СК волосяного фолликула в виде повышения уровня экспрессии протеина цито-кератина-15 [11]. Ранее было показано, что СК бипо-тентны и они способны к перемещениям в эпидермис при регенераторных процессах [14-17]. Также обнаружено, что СК волосяных фолликулов мульти-потентны. Например, при аутотрансплантации волос СК дают начало всем линиям клеток, участвующим в формировании волоса, кроме того, обнаружено, что многочисленные фолликулы были сформированы от дочерних генераций всего одной СК [14,16,18-20].

Таким образом, результаты исследований отечественных и зарубежных исследователей доказывают, что часть клеток волосяных фолликулов являются СК у взрослых млекопитающих. Участие данных клеток в регенераторном процессе было подтверждено гистологическими исследованиями кожи группы животных, получавших ПСР-1, также отмечено усиление роста волос в группе, получавшей данный препарат. Хотя оба исследуемых препарата (ПСР-1 и ПСР-2) оказывают влияние на скорость заживления раны после ТТ, большей эффективностью обладает ПСР-1, вполне возможно, за счет активации СК волосяных фолликулов. Использование данного препарата также может быть эффективным при тяжелых ТТ, сопровождающихся пересадкой кожи для получения наилучшего косметологическош и эстетического результата.

Выводы

Таким образом, в результате оценки процесса заживления ран при экспериментальных ТТ с применением образцов мази, содержащих стимуляторы регенерации (ПСР-1, ПСР-2), можно сделать следующие выводы:

  1. Стимуляторы регенерации ПСР-1 и ПСР-2 достаточно эффективны для лечения экспериментальных ожоговых ран у белых крыс в сравнении с контрольной группой.
  2. При лечении ожоговых ран экспериментальной мазью ПСР-1 сокращается срок заживления ожоговых ран за счет раннего начала эпителизации с вовлечением СК волосяных фолликулов.
    Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии явного или потенциального конфликта интересов, связанного с публикацией статьи.